第二章　蜱媒传染病流行病学调查研究案例

提要

一、世界首次发现和命名一种无形体病的监测研究

（一）研究背景

无形体病是一种人畜共患病，迄今为止，有两种无形体疾病被证实能够感染人。一种是嗜吞噬细胞无形体（Anaplasma phagocytophilum），引起的疾病被称作人粒细胞无形体病，在我国、美国和欧洲均有报道，其常见的临床表现包括发热、头痛、倦怠和肌痛等，临床感染谱从无症状感染到轻度或重度的发热性疾病，同时伴随多器官的衰竭，甚至死亡［3］。另一种是绵羊无形体（Anaplasma ovis），2007年赛浦路斯报道一名患者，临床表现为发热、肝脾肿大，以及淋巴系统病变，除此之外，没有其他绵羊无形体病的报道［4］。

2012—2013年黎浩等人开展了我国东北地区无形体感染羊的调查研究，发现了一种未知的病原体，基于16SrRNA基因序列分析，认为是一种新的无形体，该病原体通过HL-60细胞（人早幼粒白细胞）培养成功［5］。由于这种病原体能够在人源细胞生长，所以推测其可能可以感染人，因此在蜱媒传染病哨点医院对其开展了主动监测。

（二）研究方法

在黑龙江省牡丹江林业中心医院开展主动监测研究，该医院是牡丹江市最大的医院之一。研究人员收集登记了2014年5月1日至6月10日之间因蜱虫叮咬收治入院的病人，每个病人都填写了标准的调查问卷以便收集人口学信息、药物治疗史和环境暴露信息。通过病历获得临床表现、实验室检查、治疗、预后信息。患者被咬后来医院救治时及时采集了全血和血清。通过新发无形体特异性PCR检测和序列分析，病原体分离培养鉴定，及双份血清特异性抗体检测，确诊新发无形体感染患者。同时，在调查研究期间收集同一地区4个不同地点的动物身上的蜱，采用相同的PCR检测方法检测该病原体。

（三）研究结果

该研究收集了被蜱虫叮咬前来救治的患者血清477份，经过巢式PCR检测发现28例新发病原体感染患者，28例患者中有12份血液样本可以用于病原体分离培养，其中5份接种在HL-60上，成功分离两株，其他7份同时接种在HL-60和THP-1（human myelomonocytic leukaemia）细胞系，在THP-1中获得一株菌株。接种后21天，HL-60细胞中的桑椹体感染率达30%，接种后24天在THP-1细胞中观察到了桑椹体，到第36天时，20%THP-1细胞含有桑椹体，免疫荧光实验证实其为无形体（图2-1）。

rrs、gltA、groEL、msp2、msp4基因序列分析显示，rrs的全长与先前存在的序列有46个碱基不同，在高变区有差异。进化树显示rrs处于无形体属，但与以往报道的无形体属病原体处于不同的分支，深入分析发现该病原体的gltA、groEL、msp2、msp4基因与已经存在的无形体相似性分别为76%～83%、68%～75%、48%～75%和64%～76%。基于核苷酸和氨基酸的四种基因进化树分析，该无形体为一种新的无形体，由于来源于山羊，所以暂时将其命名为“山羊无形体”（Anaplasma capra）。

24名患者中22名“A. capra”抗体从急性期到恢复期有4倍增长，其他两名患者虽然IgG抗体阳性，但未观察到4倍增长。其余4名患者只有急性期或恢复期其中一份血清样本，3名是阳性，1名患者没有血清学证据证明有“A. capra”抗体，28例病例中的8名患者的血清检测为A. phagocytophilum，未检测到查菲埃里克体。

为了排除其他蜱传病原体感染，研究者采用实时定量荧光PCR和普通PCR检测了嗜吞噬细胞无形体、查菲埃里克体、斑点热群立克次体、巴贝虫、伯氏疏螺旋体、土拉热杆菌、新型布尼亚病毒及蜱传脑炎病毒，这28名患者均为阴性。

28名患者的平均年龄为47岁，女性20名。28名患者均有蜱虫叮咬史，主要被叮咬部位为头皮、耳朵、后背以及腹部，树林是最易发生蜱虫叮咬的地方。叮咬后就医时间从1天至17天不等。这28名患者在过去6个月内未输过血，也未做过脾脏手术，其中4名患者患高血压、高血糖、冠心病、肥胖、口腔癌症。

“A. capra”感染引起的症状主要有发热、头痛、萎靡、眩晕、寒战，胃肠道症状如恶心、呕吐、腹泻，以及皮疹、焦痂等。通过显微镜和血液涂片检查发现没有典型的桑椹体，最常见的实验室检查异常是肝功能异常，其次是白细胞和血小板减少。

在调查点附近共采集了628只蜱，包括447只全沟硬蜱和181只嗜群血蜱，其中全沟硬蜱“A. capra”检出率为3%（13/447），嗜群血蜱全部阴性，蜱的gltA序列和患者完全相同。

（四）分析与结论

这种新发病原体在女性中较为常见，与其他蜱传疾病引起的淋巴系统症状类似［6］。目前这种性别差异还无法解释，感染新病原体的临床表现主要有发热、头痛、不适等，很难与其他急性发热性疾病区别开来。研究病例中没有免疫力低下的患者。这种新发病原体以皮疹为常见症状。有3名患者出现焦痂，这是立克次体的常见症状，但是通过检测，未发现立克次体。1名患者出现中枢神经系统症状，脑脊液中检测到病原体，感染嗜吞噬细胞无形体时会出现中枢神经系统症状［7］，因此还有待深入研究。四环素是无形体和埃里克体病有效的治疗方法［8-9］，“A. capra”感染患者在接受多西环素治疗之后也会痊愈，表明多西环素能够有效治疗这种疾病，但还需要体外实验来支持这一结果。

所有无形体属病原体都可以通过蜱传播，在全沟硬蜱中发现这种新病原体而嗜群血蜱中未发现，因此全沟硬蜱可能是主要媒介。全沟硬蜱广泛分布于俄罗斯到东亚一带［10］，如果“A. capra”流行起来，那么只要有全沟硬蜱生活的地方都有可能感染人或宿主动物，需要进行更广泛的监测。另外，山羊可能是其主要动物宿主，“A. capra”是否能感染其他反刍动物还有待进一步研究。

结论：该研究发现了28名山羊无形体病患者。“A. capra”与其他的无形体属病原体不同，能够在人的细胞内生长（HL-60和THP-1细胞），这也提示我们这种病原体能够感染人类［11］，虽然无形体属病原体都能感染外周血细胞，但“A. capra”是更接近于能够感染哺乳动物红细胞的病原体［12］。因此，该研究推测“A. capra”能够感染哺乳动物红细胞［13］，但需要进一步的调查确认人体内的宿主细胞以及感染脊椎动物的宿主细胞。

二、我国48例猎户巴贝西虫感染病例的流行病学描述性研究

（一）研究背景

人巴贝虫病是由红细胞内的巴贝原虫引起的一种蜱传疾病，经血液传播［14-15］。上百种巴贝西虫能够感染多种野生动物和家畜，但是仅少数感染人类［16］。美国大部分病例是微小巴贝西虫感染，也有部分邓肯巴贝西虫和分歧巴贝西虫感染病例［17］。在非洲、南美洲、亚洲地区有类微小巴贝西虫和未定种的巴贝西虫感染散发病例，欧洲的40例确诊病例中，猎户巴贝西虫（“Babesia venatorum”）是主要的病原体［18-20］。在中国，有13例巴贝西虫病例报道，其中10例感染微小巴贝西虫［21-22］、2例感染分歧巴贝西虫［23］、1名儿童感染猎户巴贝西虫［24］。

（二）研究方法

从2011年到2014年每年的5月至7月，在牡丹江林业中心医院收集因蜱虫叮咬来院救治的患者。在患者来院救治的同时，我们通过填写调查问卷获取人口学信息、药物使用史、蜱虫暴露史以及输血史，其他信息如临床症状、慢性病史、实验室检查等从病历获得。采用美国CDC提出的病例定义，确诊病例有一个或多个主观及客观的临床症状，主要包括发热、贫血、血小板减少、畏寒、出汗、头痛、肌痛、关节痛；至少有一种实验室诊断指标，PCR巴贝西虫阳性、光学显微镜下血涂片检查阳性或者分离到巴贝西虫。另外，我们使用FISH的方法，用特定的探针来检测猎户巴贝西虫。患者的外周血涂片进行吉姆萨染色后，用光学显微镜进行观察，检查红细胞内是否存在寄生虫。

PCR检测阳性的患者再次采集一份血样，将0.5mL的血液注射到免疫力低下的小鼠体内，每隔三天吉姆萨染色检查一次，随后进行PCR检测。在阳性结果出来之前测试进行了八周。

此外，本项研究检测分析了血清白介素12 p70、17A、2、10、9、22、6、13、4、5和1β，以及γ干扰素和肿瘤坏死因子、细胞黏附因子、血管细胞黏附因子、血小板内皮附着因子。

在本研究中，采用布旗法进行游离蜱的采集，即在蜱虫叮咬患者的地区，用白旗从灌木丛和草丛上掠过。通过PCR检测巴贝西虫并测序确定。本研究检测的18S rRNA与先前释放的基因序列进行比较，运用MEGA软件构建系统发育树。

对所有变量进行统计学分析，连续型变量用中位数和范围来表示，分类变量用频率和比例来概述。为了明确组间差异，运用卡方检验和Fisher确切概率法。P值小于0.05有统计学意义，所有的分析均采用SAS软件。

（三）研究结果

本研究2 912例被蜱虫叮咬过的患者中，48例巴贝西虫检测阳性，对这48例患者的18S rRNA序列进行分析，发现是“B. venatorum”。从4例确诊病例的血液中得到巴贝西虫18S rRNA全长，同源性为100%。收集了48例患者中31例患者的外周血，进行涂片，吉姆萨染色后观察细胞内是否存在巴贝西虫。其中21例患者红细胞内存在巴贝西虫，寄生虫的环状结构在红细胞内最常见，其次是成对的梨形结构，四分体虽然很少见，但是偶然也可以观察到。31个外周血涂片中，12个巴贝西虫特异性FISH实验阳性（图2-2）。

给小鼠体内注射巴贝西虫阳性血样，注射后6～9天，采集小鼠血液进行吉姆萨染色镜检发现为“B. venatorum”阳性。通过巢式PCR扩增小鼠血样中的核酸，对PCR产物进行序列分析发现与患者血液中的序列一样，但是在注射后21～27天寄生虫血症发生率依然很低（1%～3%）。

48例患者中，有32例出现了临床症状或实验室检查阳性指标，临床症状主要有发热、贫血、血小板减少、多汗、畏寒、头痛、肌痛、关节痛。其他16例未出现相应临床症状，为疑似病例。这些患者平均年龄为45岁（从7个月到75岁不等），女性患者30例，11例确诊病例和7例疑似病例的年龄超过50岁，确诊和疑似病例年龄分布相似，所有病例均有蜱虫叮咬史，叮咬部位主要集中在头皮、耳朵、颈部，其次是躯干和四肢。森林是最容易发生蜱虫叮咬的地方，其次是田野和公园。患者近两年均没有输血和脾脏切除手术史。

发热是最常见的临床表现（66%），其次是头痛（41%），肌肉痛和关节痛（38%），寒战（9%），淋巴结肿大（6%），其他临床表现主要有疲乏、头晕、嗜睡、恶心、红斑、皮疹等。2名儿童除发热外没有其他症状。4名年龄超过50岁的确诊病例有基础疾病，分别为糖尿病、高血压、阑尾切除术后以及子宫肌瘤切除术后。6例出现皮疹的确诊病例莱姆病血清学检测阳性。1例确诊病例森林脑炎病毒IgG抗体阳性。7名患者因高热而入院，平均留院时间为16天，其余患者均为门诊患者。

通过比较40例患者的感染细胞因子和黏附因子发现，与对照相比较，确诊病例ICAM-3、P-selectin和PECAM-1的浓度增高，肿瘤坏死因子和VCAM-1升高；疑似病例ICAM-3和PECAM-1的浓度有所降低。在确诊病例和疑似病例中没有发现其他细胞因子浓度的改变。

13例患者有治疗史，其中8例采用青霉素治疗，5例采用头孢菌素治疗。只有4例住院的患者使用一种巴贝西虫特异的抗生素进行治疗，无死亡病例。

本研究共采集1 079只成蜱，其中819只全沟硬蜱，260只嗜群血蜱。“B. venatorum”阳性率为1%（8只全沟硬蜱阳性，嗜群血蜱全部阴性）。

（四）分析与结论

48例“B. venatorum”患者中，16例未出现临床症状，与微小巴贝西虫感染类似［25］，约50%的儿童和25%的成年人无症状。本研究的结果也类似于微小巴贝西虫感染，免疫力低下的患者更易感，医务人员需要重视这些病原体所带来的重大健康威胁，因为巴贝西虫感染人体可以存在很长时间的无症状期，这将会增大输血感染的风险［26］。32例确诊病例的临床表现与欧洲报道的4例病例的表现相似，本研究的病例免疫功能完好，欧洲的4例病例患有免疫系统缺陷相关疾病［27］。这种巴贝西虫可以感染健康者，且临床症状从轻到重不等，所以一旦发现感染，应当立即入院治疗。

巴贝西虫的致病机制与宿主细胞的反应有关［28］。研究者将48例患者血清细胞因子和黏附因子与健康血清进行比较发现，确诊病例和疑似病例肿瘤坏死因子和VCAM-1的浓度都有所增高，该结果与微小巴贝西虫感染的结果相似，细胞因子的增高不仅会恶化疾病，还会导致严重的并发症［28］。

无症状的巴贝西虫感染者通常不会接受任何治疗，但是应该及时采取治疗，因为寄生虫能在体内存在3个月以上，若不进行治疗，可能会引起输血感染，这将导致严重的公共卫生问题［29］。48例患者被叮咬后，研究者立即在同一季节采集了疫区的蜱，全沟硬蜱中“B. venatorum”阳性检出率为1%，这个结果提示我们，对于巴贝西虫感染的诊断要从蜱虫活动度高的地方入手，在欧洲地区，羊身上的革蜱是“B. venatorum”的主要传播媒介［26］。

该研究还存在些许局限［30］。首先，存在入院率偏倚，因为患者来自同一地区的同一医院，所以无法确定当地的巴贝西虫感染率，部分被叮咬的患者未去医院就诊，因此需要更加严谨的流行病学调查来探知当地真正的流行情况。其次，来院就诊的患者大部分在门诊接受治疗，而未进行身体检查和基本的实验室检查，这就影响了临床诊断。再次，本研究没有进行积极主动随访，可能损失部分有意义的结局信息。

结论：本研究共分析48例“B. venatorum”感染者。对巴贝西虫感染有确诊意义的诊断方式是对血液样本进行吉姆萨染色后镜下观察，然而对于免疫力低下的患者却无法进行血涂片检测，而且经常会导致误诊［27］。有特异探针的FISH法能准确地诊断出寄生虫病，PCR检测是最敏感有效的方式，也可以用来确定感染的物种。巴贝西虫病是典型的蜱传疾病，在这些患者中，每个人都有蜱虫叮咬史，且在两年内没有输血史。森林是最易发生蜱虫叮咬的地方，这48例患者均居住在我国东北地区的山区，因此预防控制的重点要放在这些山区。本研究中有2例婴儿病例，都有蜱虫叮咬史，其母亲均未感染巴贝西虫，因此排除了先天性感染。

三、我国新发蜱媒传染病时空分布研究

（一）研究背景

蜱被视为能够将病原菌传给人类的能力最强的节肢动物。蜱媒传染病是人畜共患病，病原体在自然界中循环维持，涉及蜱和动物宿主。人类是蜱的偶然宿主，通常被看作是终末宿主。不同的蜱种倾向于在不同的生物群落或环境中生活，这影响了它们的地理分布，从而也影响了人感染蜱媒病的风险区域。在过去三十年中，世界范围内出现新发蜱传病原体，并成为对人类健康的巨大威胁。中国是世界上最大的发展中国家，在预防和控制传染病方面取得了巨大进展。人们高度关注SARS、H5N1和H7N9禽流感的暴发，但却忽略了新发蜱传疾病。虽然中国内地有越来越多蜱传疾病的病例报告，但尚未对这一重大公共卫生问题进行全面调查。

（二）研究方法

我们通过蜱媒病（tick-borne disease）、蜱媒人畜共患病（tick-borne zoonosis）、蜱媒动物源性疾病（tick-borne zoonotic disease）、蜱相关病原体（tick-associated agent）、蜱相关微生物（tick-associated microbe）几个关键词分别与5个蜱属的名称组合进行搜索，从PubMed和ISI Web of Sciences收集了英文文献，从万方数据库、中国国家知识基础设施与中国科技期刊数据库收集了中文文献。此后，基于以上文献，我们又二次搜索了引用这些文章的文献。对所有收集到的文献，通过联系通信作者获得了发现时间、发现地点以及蜱种等一系列细节信息，基于这些信息，我们研究了蜱相关病原体在蜱、人以及动物中的检出率和感染比例。

（三）研究结果

据报道，6个属下的33种蜱虫能够携带新发蜱相关病原体，这些病原体能够感染牲畜并有可能最后造成人类感染。多种生物学因素能够影响蜱媒病原菌对人的感染，例如能够促进蜱媒人畜共患病传播的蜱-宿主群落的动态；土地利用类型的改变，不仅仅在森林重建过程中，在利用森林并引起森林退化的过程中也能够引起蜱媒病发病率的上升。例如在发热伴血小板减少综合征高发地区，灌木、森林以及农田地区的植被覆盖率每上升10%，发热伴血小板减少综合征发病率分别提高51%、51%和90%。城市化进程中对森林的利用、对现有绿地的保护能够为蜱虫在城市中的生存提供条件，进而提高蜱媒病的发病率。世界气候环境的改变一定程度上也能够影响蜱媒病的发病率。

（四）分析与结论

毫无疑问，分子生物学技术的进步和应用能够帮助识别人类感染的各种病原体，因此，在某种程度上，通过运用高效灵敏的检测方法，我们可以发现新的病原体。然而，多种生物学因素，比如蜱虫和宿主人口动态，导致了蜱传疾病的增多，这可能是导致这些疾病快速传播的主要因素。地域的改变也影响着蜱传疾病的发生发展。美国东北部莱姆病的出现，是由于这个地区在20世纪林业重建时增加了白尾鹿的数量从而增加了硬蜱的数量，后者导致美国莱姆病发病率增加［31］。在加拿大和美国的小型森林里，由于捕食者的减少，小型哺乳动物开始增多，于是增加了伯氏疏螺旋体的感染概率。在这些地区生活的居民相比起其他居民的莱姆病发病率更高［32］。

20世纪90年代中期，中国政府已经实行退耕还林的政策，植树造林可以增加蜱和宿主动物的数量，从而增加了蜱传疾病的传播概率［33］。研究表明，新布尼亚病毒的感染与农业地区有很大关系，灌木林、森林以及雨水灌溉的农田面积分别增加10%，相对应的人类感染新布尼亚病毒的概率分别增加51%、50%和90%［34］。

另外，城市化的发展增加了蜱传疾病的传播概率。许多宠物以及家畜身体上能寄生蜱，作为蜱的宿主，也作为携带病原体的主要传播媒介，增加了人类病原体和动物病原体的感染概率［35］。在过去的30年里，中国作为发展最快的城市化国家，随着城市化的发展，伴随着人群从农村向城市的迁移、远程贸易、短途购物等，导致了大量的健康风险，包括空气污染、职业和交通危害，以及改变了饮食和活动［36］。所有这些人类活动的改变，以及更多的人与人之间的接触，包括与宠物以及自然界的接触，很可能导致蜱虫的数量进一步增加。新兴的蜱传疾病和城市化的关系还需要进一步的调查来证实。

全球气候变化影响自然疫源性疾病的强度不及土地利用、动物宿主的变化、社区、人类生活条件方面的因素［37］。尽管气候变化与疫源性疾病的传播呈非线性关系，蜱虫的季节性消长很大程度上取决于温度条件的改变，在长远方面影响着蜱传疾病［38］。众所周知，冬季气温升高，将会增加硬蜱的数量，从而增加患蜱传播疾病的风险。尽管还有待确证，但可以确定的是温度的变化确实是影响蜱传疾病流行的一个因素［39］。为了更好地阐明这个问题，需要进一步的研究。

结论：自1982年起，我国发现33种新发现的蜱媒病原体，包括8种斑点热群立克次体、7种无形体科病原体、6种伯氏疏螺旋体、11种巴贝西虫以及新型布尼亚病毒。19种病原体最初在蜱中被检测到，6种在家畜中被检测到（绵羊、山羊、牛、狗），2种在野生动物中被检测到（中华白腹鼠和中华野兔），还有6种在人体内被检测到。在33种新发现的蜱相关病原体中，15种能对人致病，其中6种蜱传病原体在发热病人中首次被发现，随后发现与蜱有密切关系。其他9种病原体是在蜱和其他动物中被发现后，经证实能感染人体［40］。

（军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所　贾娜　曹务春）