第四节 支原体的生长和培养特性
支原体虽然能在无生命培养基中繁殖，但支原体对营养物质的要求比一般细菌高，除了无胆甾原体外，其他支原体的培养需在培养基中加入10%～20%的牛或马血清，以提供细胞膜合成所需的胆固醇和其他长链脂肪酸，并可稳定细胞膜。
一、生长特性
支原体的繁殖速度比细菌慢，其世代时间为1～3h，长者达6～9h。支原体的繁殖方式多样，除了以二分裂方式进行繁殖外，还有分节、出芽或分支和断裂（球体延伸形成丝状后断裂成球杆状颗粒）等繁殖方式。如肺炎支原体在增殖过程中，由于胞膜的分裂滞后于核酸的复制而形成含多数球形原生小体的多核丝状体。鸡毒支原体繁殖时先在极端产生泡状突起，由此小泡形成均等分裂。鼠肺支原体则以出芽方式增殖。
支原体的群体生长曲线类似于细菌，但生长量相对较低，如解脲脲原体生长量最大时也只有106～107CFU/ml。这除了与支原体对营养物质的要求较高有关外，还与培养基中的蛋白胨和酵母提取物中可能含有抑制支原体生长的因子有关。
支原体一般在pH 7.6～8.0时生长较好，低于7.0则被抑制或死亡。但嗜热原体在pH 2.0～3.0的酸性环境中生长较好。解脲脲原体生长的最适pH为5.5～6.5，因为解脲脲原体在培养时能分解尿素产生NH3，使pH升高，如不及时移种，会迅速死亡。若能利用缓冲系统中和所产生的NH3，则可使解脲脲原体继续生长。但支原体对渗透压较敏感，环境中的渗透压应保持在1×104～1.4×104Pa，因此培养基中需要提供合适浓度的缓冲物质。
不同支原体对氧的需求不一样，初次分离的支原体多数为兼性厌氧，少数在有氧条件下能生长，但一般在含5%～10% CO2、90% N2和80%～90%的相对湿度环境中生长良好。厌氧原体对氧气相当敏感，必须严格厌氧。支原体生长时也需要合适的温度，虽然在22～41℃时均能生长，但以36～37℃最适宜。寄生性支原体在37℃生长最好，而腐生性支原体则在22～30℃生长较好。热原体的最适生长温度为59℃。
二、培养特性
（一）液体培养
支原体在液体培养基中的生长曲线与细菌相同，可分为迟缓期、对数生长期、稳定期和衰老期。但支原体在液体培养基中的生长量较少，生长后培养基清亮，也有的呈不显著的混浊或呈极浅淡的均匀混浊，观察时须与未接种管作对比。有的呈颗粒样生长或形成薄片状小集落，肺炎支原体呈丝状样生长，它们均黏附于管壁或沉于管底。通常需在培养基中加入一些底物和pH指示剂，根据底物分解使培养基的pH发生改变导致颜色变化来判断有无支原体的生长。在液体培养基中支原体增殖量不超过106～107/ml颜色变化单位（color changing unit, CCU），将支原体接种在一定量的鉴别培养基中，能分解底物并使指示剂变色的最小支原体量，故液体清亮。
（二）固体培养
支原体生长缓慢，在含少量琼脂的固体培养基上孵育2～3天（有的需要2周）后能形成直径10～600μm大小的菌落，因菌落小，至少在低倍显微镜下才能观察到。典型的菌落呈“油煎蛋”样：菌落呈圆形，中心致密隆起，呈颗粒状，陷入琼脂内部；边缘整齐，周边为一层薄薄的透明颗粒区，在琼脂表面散开；有的整个菌落呈颗粒状。菌落较小时常为无色，陈旧后变成淡黄或棕黄色。有些菌种在菌落周围的培养基上可形成“波纹状薄膜和小黑点”，称为薄膜点。薄膜是由胆固醇与磷脂质所形成的，而小黑点是从脂肪酸游离出的钾及镁盐的沉淀物，这些都是支原体分解脂质后所产生的，因此可根据此现象鉴定支原体的菌种。由于支原体不耐干燥，用固体培养基培养时应保持一定的湿度。
不同支原体菌落大小不一，人型支原体的菌落比较典型，肺炎支原体初次分离时周边不明显，经数次传代后菌落才趋近典型，菌落较大，直径100～150μm。某些牛型支原体和大部分无胆甾原体菌落的直径可达2mm，肉眼即可看到；而解脲脲原体的菌落缺乏外周生长区域，菌落直径仅15～60μm，故曾称为“T株”（tiny strain）。螺原体由于有螺旋形长丝在柔软的琼脂中移动，故形成的“油煎蛋”菌落不明显。另外，多数支原体在含0.3%琼脂的半固体培养基中能生长出“彗星状”菌落，长度为1～2mm，肉眼可以看到，具有致密的头部和疏松的尾部，头部在上，尾部在下。厌氧支原体在培养基中、下部生长，需氧支原体如肺炎支原体则在培养基表层生长，呈颗粒状，无尾端。菌落的外形和大小取决于培养基的组分、水合作用的程度、琼脂糖的浓度、大气环境和培养时间等。固体培养基中琼脂的浓度应小于1.2%，以利于典型“油煎蛋”菌落的形成。
（曾焱华）